اساس عملکرد میکروسکوپ الکترونی عبوری (Transmission Electron Microscope) که به اختصار به آن TEM گویند مشابه میکروسکوپ‌های نوری است با این تفاوت که به‌جای پرتوی نور در آن از پرتوی الکترون استفاده می‌شود. آنچه که می‌توان با کمک میکروسکوپ نوری مشاهده کرده بسیار محدود است؛ در حالی‌که با استفاده از الکترون‌ها به‌جای نور، این محدودیت از بین می‌رود. وضوح تصویر در TEM هزار برابر بیشتر از یک میکروسکوپ نوری است.

با استفاده از TEM می‌توان جسمی به اندازه چند آنگستروم (10-10 متر) را مشاهده کرد. برای مثال می‌توانید اجزای موجود در یک سلول یا مواد مختلف در ابعادی نزدیک به اتم را مشاهده کنید. برای بزرگ‌نمایی، TEM ابزار مناسبی است که هم در تحقیقات پزشکی، زیست‌شناسی و هم در تحقیقات مرتبط با مواد قابل استفاده است.

در واقع TEM نوعی پروژکتور نمایش اسلاید در مقیاس نانو است که در آن پرتویی از الکترون‌ها از تصویر عبور داده می‌شود. الکترون‌هایی که از جسم عبور می‌کنند به پرده فسفرسانس برخورد کرده، سبب ایجاد تصویر از جسم بر روی پرده می‌شوند. قسمت‌های تاریک‌تر بیان‌گر این امر هستند که الکترون‌های کمتری از این قسمت جسم عبور کرده‌اند (این بخش از نمونه، چگالی بیشتری دارد) و نواحی روشن‌تر، مکان‌هایی هستند که الکترون از آنها عبور کرده است (بخش‌های کم چگال‌تر).

وضوح این میکروسکوپ 0/2 نانومتر است که در حد اتم است (بیشتر اتم‌ها ابعادی تقریبا برابر 2/0 نانومتر دارند). با این نوع میکروسکوپ حتی می‌توان نحوه قرار گرفتن اتم‌ها در یک ماده را بررسی کرد.

استفاده از این میکروسکوپ گران و وقت‌گیر است، چرا که نمونه باید در ابتدا به شیوه‌ای خاص آماده شود، لذا تنها در مواردی خاص از میکروسکوپ الکترونی عبوری استفاده می‌نمایند. از این میکروسکوپ جهت تحلیل و آنالیز ریخت‌شناسی، ساختار بلوری (نحوه قرارگیری اتم‌ها در شبکه بلوری) و ترکیب نمونه‌ها استفاده می‌شود.

 

با کمک یک منبع نور در بالای میکروسکوپ، الکترون‌ها گسیل و منتشر می‌شوند. الکترون‌ها از تیوب خلاء میکروسکوپ عبور می‌کنند. در میکروسکوپ‌های نوری از عدسی‌های شیشه‌ای برای متمرکز کردن نور استفاده می‌شود، در حالی که در TEM از عدسی‌های الکترومغناطیسی استفاده می‌شود تا الکترون‌ها را جمع و متمرکز ساخته به صورت یک پرتوی باریک گسیل نماید. این پرتوی الکترونی از نمونه عبور داده می‌شود. بسته به چگالی مواد، الکترون‌ها ممکن است از بخش‌هایی از جسم بگذرند و به صفحه فلورسانس برخورد نمایند و تصویر سایه مانندی از نمونه ایجاد کنند که میزان تیرگی بخش‌های مختلف جسم به چگالی مواد در آن بخش‌ها وابسته است. هر چه جسم کم چگال‌تر باشد تصویر تیره‌تر خواهد بود. این تصویر می‌تواند مستقیما توسط اپراتور مطالعه شود و یا با کمک یک دوربین، تصویربرداری شود.

 

شکل 1. میکروسکوپ الکترونی روبشی TEM

 

همان‌طور که در بالا اشاره شد، آماده کردن نمونه نیز به دقت خاصی نیاز دارد که در ادامه به نحوه آماده‌سازی نمونه برای مطالعه آن با TEM اشاره می‌شود.

نمونه‌ای که می‌خواهید با TEM بررسی کنید، باید چگالی آن به حدی باشد که اجازه دهد تا الکترون‌ها تا حدی از آن عبور کنند. راه‌های مختلفی برای تهیه این نوع نمونه وجود دارد. می‌توانید برش‌های بسیار نازک از نمونه مد نظر تهیه کنید و آن را در یک پلاستیک، ثابت نمایند یا اینکه آن را منجمد کنید. روش دیگر تهیه نمونه ایزوله کردن نمونه و مطالعه محلولی از مولکول‌ها یا ویروس‌های مورد نظر با کمک TEM است.

همچنین می‌توان نمونه را با روش‌های مختلف رنگ کرد و با استفاده از نشانه‌گذاری، آن را مطالعه کرد. برای مثال، فلزات سنگین رنگ شده مانند اورانیوم و سرب، الکترون‌ها را به خوبی متفرق می‌کنند و کنتراست نمونه را در زیر میکروسکوپ بهبود می‌بخشند. در ادامه روش تهیه دو نمونه برای مطالعه آنها با TEM آورده شده است:

 

شکل 2 . آماده سازی نمونه TEM

 

1- تهیه برش با کمک مواد در برگیرنده: مواد زیستی شامل مقادیری آب هستند. با توجه به اینکه برای استفاده در TEM باید کار در خلاء انجام شود، لازم است تا آب به گونه‌ای تبخیر و یا جداسازی شود (با کمک الکل یا استون) و در نهایت نمونه فیکس و ثابت می‌شود. حال نمونه در پلاستیکی محصور می‌شود (به شکل یک بلوک پلاستیکی سخت) و سپس برش‌های نازکی از آن به کمک چاقوی الماس مربوط به دستگاه اولترامیکروتوم (برای ایجاد برش‌های بسیار ظریف) تهیه می‌شود که تنها 100-50 نانومتر ضخامت دارند. برش‌های تهیه شده روی یک توری مسی قرار داده می‌شوند و با کمک فلزات سنگین رنگ می‌شوند. حال نمونه بافت آماده مطالعه با کمک پرتوی الکترونی TEM است.

2- تهیه نمونه به روش رنگ کردن: در این روش از مواد ایزوله (که می‌توانند برای مطالعه باکتری‌ها و یا مولکول‌های ایزوله استفاده شوند) استفاده می‌شود، به این طریق که ابتدا محلول محتوای باکتری روی توری ریخته و با پلاستیک پوشانده می‌شود. محلول نمکی یک فلز سنگین (مانند اورانیوم یا سرب) به آنها اضافه می‌شود. محلول نمکی فلز با مواد ترکیب نمی‌شود اما هاله‌ای را در اطراف آن، روی توری تشکیل می‌دهد. نمونه به صورت یک تصویر منفی، هنگامی که با کمک TEM مورد مطالعه قرار می‌گیرد، نمایان می‌شود.

 

شکل 3. آماده سازی TEM برای کارهای بیولوژیکی

 

میکروسکوپ الکترونی روبشی که به آن Scanning Elecron Microscope یا به اختصار SEM می‌گویند، یکی از ابزارهای مورد استفاده در فناوری نانو است که با کمک بمباران الکترونی تصاویر اجسامی به کوچکی 10 نانومتر را برای مطالعه تهیه می‌کند. ساخت SEM سبب شد تا محققان بتوانند نمونه‌های بزرگ‌تر را به سادگی و با وضوح بیشتر مطالعه کنند. بمباران نمونه سبب می‌شود تا از نمونه، الکترون‌هایی به سمت صفحه دارای بار مثبت رها شود که این الکترون‌ها در آنجا تبدیل به سیگنال می‌شوند. حرکت پرتو بر روی نمونه مجموعه‌ای از سیگنال‌ها را فراهم می‌کند که بر این اساس میکروسکوپ می‌تواند تصویری از سطح نمونه را بر صفحه کامپیوتر نمایش دهد. SEM اطلاعات زیر را در خصوص نمونه در اختیار می‌گذارد:

 

- توپوگرافی نمونه: خصوصیات سطوح

- مورفولوژی: شکل، اندازه و نحوه قرارگیری ذرات در سطح جسم

- ترکیب: اجزایی که نمونه را می‌سازند

 

SEM وسیله‌ای است که به کمک آن می‌توان تصویر بزرگ‌تر از نمونه را با کمک الکترون‌های (به جای نور) خلق کرد. پرتویی از الکترون‌ها با کمک تفنگ الکترونی میکروسکوپ تولید می‌شود.

 

                          شکل 4. میکروسکوپ الکترونی روبشی SEM

 

پرتوی الکترونی در خلاء به صورت عمودی از میکروسکوپ عبور می‌کند. سپس با عبور از میدان‌های الکترومغناطیسی و لنزهای ویژه به صورت متمرکز به نمونه تابانده می‌شوند. به محض برخورد پرتو با نمونه، الکترون‌ها و اشعه‌های ایکس از نمونه خارج می‌شوند.

 

شکل 5. واکنش جسم در هنگام برخورد پرتو الکترونی با آن

 

سپس آشکارسازها پرتوهای ایکس، الکترون‌های اولیه و الکترون‌های ناشی از برخورد الکترون‌های اولیه با جسم را جمع‌آوری می‌کنند و آنها را به سیگنال مبدل کرده به صفحه نمایش (مانند صفحه تلویزیون) منتقل می‌کنند و به این طریق تصویر نهایی تهیه می‌شود.

 

قبل از هر کار باید آب از نمونه جدا شود چرا که آب در خلاء تبخیر می‌شود. تمامی فلزات رسانا هستند لذا نیازی به آماده‌سازی آنها برای تهیه تصویر با SEM نیست. موادی که جزء دسته فلزات نیستند، باید به وسیله یک لایه نازک رسانا پوشانده شوند. این کار به کمک ابزاری به نام پوشش‌دهنده انجام می‌شود که برای این کار از میدان الکتریکی و گاز آرگون استفاده می‌شود. برای این کار نمونه در یک محفظه‌ای که خلاء قرار داده می‌شود و گاز آرگون و میدان مغناطیسی سبب می‌شوند که الکترون از آرگون جدا شده و سبب شوند تا اتم‌ها بار مثبت داشته باشند. یون‌های آرگون توسط فویل طلای دارای بار منفی جذب می‌شوند. یون‌های آرگون به اتم‌های طلای سطح فویل طلا برخورد می‌کنند. این اتم‌های طلا روی سطح نمونه قرار می‌گیرند و سبب ایجاد یک پوشش رسانا از طلا بر سطح نمونه می‌شوند.